فهرست مطالب
روش ساخت ژل الکتروفورز و بررسی محصول PCR
مبانی ژل الکتروفورز
ژل الکتروفورز یک روش دقیق و اقتصادی برای جداسازی مولکول‌های DNA، RNA یا پروتئین است که مزایای متعددی برای بررسی نتایج تست‌هایی همچون PCR دارد. این روش امکان شناسایی اندازه قطعات مولکولی با استفاده از DNA Ladder، ارزیابی کیفیت نمونه‌ها، و تحلیل سریع و بصری باندهای حاصل را فراهم می‌کند. علاوه بر این، ژل الکتروفورز ساده، سریع و مقرون‌به‌صرفه بوده و در بررسی عملکرد صحیح کیت‌ها و مقایسه نمونه‌ها به‌صورت همزمان بسیار مؤثر است. در ادامه به آموزش ساخت ژل الکتروفورز برای بررسی محصول PCR پرداخته شده است.
اهمیت و کاربرد ژل الکتروفورز
ژل الکتروفورز یک روش آزمایشگاهی است که برای جداسازی مخلوط‌های DNA،RNA یا پروتئین‌ها بر اساس اندازه مولکولی استفاده می‌شود. در این روش، مولکول‌هایی که قرار است جدا شوند، توسط یک میدان الکتریکی در ژلی که حاوی منافذ کوچک است، حرکت داده می‌شوند. سرعت حرکت مولکول‌ها در ژل به صورت معکوس با طول آن‌ها مرتبط است. به این معنی که هرچقدر یک مولکول کوچکتر باشد، مسافت بیشتری را در ژل طی می‌کند.
مواد و تجهیزات لازم برای ساخت ژل الکتروفورز
- پودر آگارز یا پلی‌آکریل‌آمید
- بافر مانند TBE یا TAE
- رنگ نوکلئیک اسید مانند اتیدیوم بروماید و یا رنگ ایمن مانند GelRed
- بافر لودکننده محصولات مانند Loading Buffer
- تجهیزات جانبی مانند قالب ژل، Comb، منبع تغذیه و تانک الکتروفورز
- UV Transilluminator مانند Gel Dock
- DNA Ladder
برای اطمینان از کیفیت ژل الکتروفورز و دقت نتایج، باید از پودرهای خالص آگارز یا پلی‌آکریل‌آمید، بافرهای استاندارد و تازه، رنگ‌های ایمن مانند GelRed، Ladder معتبر و آب دیونیزه استفاده شود. همچنین، لوازم جانبی باکیفیت و مواد اولیه از تأمین‌کنندگان معتبر، همراه با بررسی تاریخ انقضا و شرایط نگهداری، ضروری هستند. رعایت این نکات نتایج دقیق و ایمنی آزمایش را تضمین می‌کند.
اگر به دنبال مواد اولیه باکیفیت برای انجام دقیق و مطمئن آزمایش‌های ژل الکتروفورز هستید، شرکت زیست فناوری کوثر بهترین انتخاب برای شماست. برای مشاهده محصولات الکتروفورز به صفحه مربوطه مراجعه کنید.
مراحل ساخت ژل آگارز و انجام ژل الکتروفورز
- برای تهیه ژل آگارز 1.5% مقدار 3 گرم آگارز مانند MaxPure® Agarose را در 200 سی سی بافر TBE 1X حل کرده و به مدت 3 الی 4 دقیقه در ماکرو ویو قرار دهید تا محلول شفافی حاصل شود.
- برای تهیه TBE 1X از TBE 10X کافی است 100 میلی لیتر از محلول 10X را در 900 میلی لیتر آب مقطر حل کنید.
- سپس حدود دو دقیقه زمان دهید تا از حرارت افتاده و بعد به کست خود منتقل کنید.
- بعد از آن به اندازه کافی ( سی دقیقه) زمان دهید تا ژل بسته شود.
- سپس از محصول PCR خود به مقدار کافی (حدود 3 ماکرولیتر) در تیوب جداگانه الیکوت کرده و به آن PowerLoad (حاوی GelRed و Loading Buffer) اضافه کنید. پیپتاژ کنید و به چاهک‌های ژل منتقل کنید.
- به تانک الکتروفورز Running Buffer که TBE 1X است، اضافه کنید. بافر تانک باید به اندازه‌ای باشد که روی ژل را بپوشاند.
- ولتاژ تانک الکتروفورز را بر اساس نمونه، اندازه و درصد ژل تنظیم کنید.
- بعد از ران کامل نمونه‌ها روی ژل، ژل را از تانک خارج کرده و با یک دستگاه UV Transilluminator مانند ژل داک عکس ژل را مشاهده و ذخیره کنید.
- لازم به ذکر است که می‌توانید DNA Ladder نیز به همراه نمونه‌ها روی ژل ران کنید تا بر اساس آن اندازه تقریبی هر باند مشاهده شده روی ژل را بررسی کنید. توجه کنید که لدر را نیز به همراه PowerLoad ران کنید.
نحوه تنظیم ولتاژ در الکتروفورز
ولتاژ در ژل الکتروفورز به چند عامل اصلی بستگی دارد و باید بر اساس این عوامل تنظیم شود:
نوع ژل
- ولتاژ بالا اغلب باعث گرم شدن بیش از اندازه ژل می‌شود که می‌تواند تفکیک نادرست یا حتی تخریب DNA را به عنوان داشته باشد. برای ژل آگارز ولتاژ بین 80-150 معمولا ایده‌آل است.
اندازه ژل و ضخامت آن
- هرچقدر ضخامت ژل بیشتر و یا بزرگتر باشد، ولتاژ می‌بایست کمتر باشد تا گرما به‌طور یکنواخت توزیع شود و از ذوب شدن ژل جلوگیری شود.
نوع بافر و هدایت الکتریکی
- نوع و غلظت بافر مثل TAE یا TBE نقش مهمی در هدایت الکتریکی و تولید گرما دارد. بافرهای با غلظت بیشتر و در نتیجه هدایت بالاتر ممکن است در ولتاژهای بالا سریع‌تر گرم شوند. برای انجام الکتروفورز، همیشه از بافر 1X استفاده کنید، مگر اینکه در پروتکل به‌طور مشخص چیز دیگری ذکر شده باشد.
اندازه مولکول‌های مورد تفکیک
- برای جداسازی قطعات کوچکتر DNA یا RNA، ولتاژ بالاتر ممکن است سرعت تفکیک را افزایش دهد، اما در تفکیک قطعات بزرگتر، ولتاژ کمتر ترجیح داده می‌شود تا قطعات به‌درستی جدا شوند.
زمان تفکیک
- در صورتی که زمان کافی دارید، استفاده از ولتاژ پایین‌تر توصیه می‌شود تا تفکیک بهتر انجام شود. ولتاژ بالاتر ممکن است زمان آزمایش را کاهش دهد اما می‌تواند منجر به کاهش دقت در تفکیک باندها شود.
جمع‌بندی
ژل الکتروفورز یکی از روش‌های کلیدی و کاربردی در آزمایشگاه‌های زیستی برای بررسی محصولات PCR و جداسازی مولکول‌های DNA، RNA یا پروتئین‌ها است. با رعایت نکات فنی در تهیه ژل، استفاده از مواد اولیه باکیفیت، تنظیم صحیح ولتاژ و انتخاب مناسب بافر، می‌توان نتایج دقیق و قابل اعتمادی به دست آورد. این روش علاوه بر دقت و سهولت اجرا، یک ابزار اساسی برای ارزیابی کیفیت نمونه‌ها و عملکرد کیت‌ها در تحقیقات و تشخیص‌های مولکولی محسوب می‌شود.
نوشته های مشابه
