غلظت بهینه DNA | روش تنظیم غلظت DNA ورودی در خوانش
فهرست مطالب
روش تنظیم غلظت DNA ورودی در خوانش
روش تنظیم غلظت DNA ورودی در خوانش حیاتی است. در آزمایش‌های مولکولی، کیفیت نتیجه، تنها به عملکرد کیت یا دستگاه وابسته نیست؛ مقدار و کیفیت DNA ورودی نیز میتواند تأثیر مستقیمی بر کیفیت PCR و خوانش نهایی داشته باشد. ورود مقدار بیش از حد DNA به واکنش، به‌ویژه در آزمون‌هایی که محصولات PCR با Capillary Electrophoresis بررسی می‌شوند، ممکن است باعث افزایش بیش از حد شدت سیگنال و ایجاد پیک‌های اشباع‌شده شود.
اهمیت غلظت و کیفیت DNA ورودی
پیش از شروع PCR بهتر است غلظت و خلوص DNA اندازه‌گیری و کیفیت و یکپارچگی آن ارزیابی شود. این اطلاعات به انتخاب مقدار مناسب DNA ورودی و شرایط PCR کمک می‌کنند.
اگر غلظت DNA بدون ارزیابی اولیه بالا باشد و تعداد Cycle نیز بدون توجه به مقدار DNA انتخاب شود، غلظت محصول PCR میتواند بیش از حد افزایش پیدا کند. در چنین شرایطی، هنگام آنالیز ممکن است با Off-Scale یا Oversaturated Peaks و Pull-Upمواجه شویم و احتمال ایجاد خطا در آنالیز نتایج افزایش یابد.
دو معیار مؤثر در بهبود خوانش با دستگاه Genetic Analyzer
- پیک Off-Scale
- سایه
1.پیک Off-Scale
وقتی شدت سیگنال فلورسنت از محدوده قابل اندازه‌گیری سیستم آشکارسازی دستگاه خارج شود، پیک‌ها ممکن است به حالت Off-Scale یا اشباع‌شده درآیند و می‌توانند بر تفسیر نتیجه اثر بگذارد. برای مثال، در تست‌های QF-PCR و بررسی آنیوپلوئیدی‌ها، به‌ویژه تریزومی‌ها، اشباع سیگنال فلورسنت ممکن است محاسبه نسبت آلل‌ها را مختل کند. در تصویر شماره 2، یک آلل اشباع‌شده میتواند نسبت واقعی 2:1 یا 1:2 را به‌صورت 1:1 نشان دهد و احتمال تفسیر نادرست را افزایش دهد. پس از رقیق‌سازی 1:20، شدت پیک‌ها به محدوده قابل خوانش بازگشته و الگوی آللی واضح‌تر شده است.
2.سایه
یکی دیگر از مشکلات ناشی از شدت بیش از حد سیگنال به علت بالا بودن غلظت DNA، ایجاد سایه از رنگی دیگر و ایجاد سیگنال‌های اضافی در کنار پیک اصلی است .
در نتیجه، تشخیص پیک واقعی از سیگنال‌های اضافی دشوارتر شده و آنالیز صحیح نتایج ممکن است با اختلال مواجه شود. تصویر شماره3 نیز نشان می‌دهد که رقیق‌سازی میتواند به کاهش این مشکل و ایجاد الگوی خواناتر کمک کند.
تاثیرانواع دستگاه های Genetic Analyzer در خوانش
شدت سیگنال فلورسنت به عواملی مانند مدل دستگاهGenetic Analyzer، حساسیت سیستم آشکارسازی و عملکرد لیزر وابسته است.
دستگاه‌های ABI 3500 و SeqStudio معمولاً نسبت به غلظت بالای محصول PCR حساسیت بیشتری دارند. این پدیده در بسیاری از دستگاه‌های ABI 3130 کمتر مشاهده می‌شود؛ با این حال، در دستگاه‌های ABI 3130 دارای لیزر و اپتیک قوی هستند نیز امکان ایجاد پیک‌های Off-Scale وجود دارد. بنابراین، غلظت DNA ورودی و تعداد Cycleهای PCR باید متناسب با دستگاه مورد استفاده بهینه‌سازی شوند.
3 روش رفع بد کار کردن فرگمنت در خوانش
پیشگیری از ایجاد سیگنال بیش از حد، بهتر است از مرحله آماده‌سازی نمونه آغاز شود. سه روش اصلی پیشنهادشده عبارت‌اند از
- پاندازه‌گیری غلظت و ارزیابی کیفیت DNA ورودی
- استفاده از مقدار DNA ورودی در محدوده توصیه‌شده و تنظیم تعداد Cycle PCR متناسب با غلظت DNA ورودی و منبع نمونه
باید توجه داشت که در نمونه خون معمولاً DNA با غلظت و کیفیت مناسبی استخراج می‌شود و بهتر است مقدار DNA ورودی پایین‌تر انتخاب شود تا از ورود بیش از حد DNA به واکنش جلوگیری شود. در مقابل، در نمونه‌های آمنیون مقدار DNA استخراج‌شده میتواند با توجه به هفته بارداری و تعداد سلول‌های موجود در نمونه متفاوت باشد. بنابراین مقدار DNA ورودی و شرایط نمونه می‌توانند در انتخاب محدوده مناسب Cycle مؤثر باشند.تعداد Cycle پیشنهادی در صورتیکه OD>30 بهتر است در محدوده ی 25 یا 26 تنظیم شود و برای DNA با OD<30 محدوده ی 27یا 28 میتواند مناسب باشد.
- رقیق کردن محصول PCR پیش از خوانش در صورت استفاده از دستگاه های ژنتیک آنالایزر حساس تر مانند ABI 3500 یا SeqStudio در شرایطی که امکان تکرار PCR وجود ندارد.
اگر محصول PCR آماده است و امکان تکرار PCR وجود ندارد، در دستگاه‌های حساس مانند ABI 3500 یا SeqStudio می‌توان محصول PCR را پیش از خوانش رقیق کرد. نسبت رقت مناسب باید بر اساس شدت سیگنال فلورسنت و دستگاه مورد استفاده انتخاب شود.
در واقع، یک مسیر تصمیم‌گیری ساده میتواند شامل مراحل زیر باید :
- ابتدا غلظت و کیفیت DNA بررسی شود
- مقدار DNA ورودی و تعداد Cycle به‌درستی تنظیم شود
- در شرایطی که PCR صورت گرفته ، با توجه به نوع دستگاه Genetic Analyzer محصول PCR را رقیق کنید
جمع‌بندی
در تنظیم DNA ورودی برای خوانش با دستگاه ژنتیک آنالایز غلظت بیشتر DNA لزوماً به معنی نتیجه بهتر نیست. کنترل مقدار و کیفیت DNA ورودی، انتخاب تعداد مناسب Cycle و در نظر گرفتن حساسیت Genetic Analyzer میتواند از ایجاد پیک‌های Off-Scale، اشباع سیگنال و Pull-up جلوگیری کرده و کیفیت خوانش و تفسیر نتایج را بهبود دهد.
در صورت مشاهده سیگنال‌های بیش از حد، بررسی شرایط PCR و در صورت لزوم رقیق‌سازی محصول PCR پیش از Capillary Electrophoresis میتواند یکی از راهکارهای مؤثر برای دستیابی به الگوی قابل خوانش‌تر باشد.