روش و کاربرد آنالیز فرگمنت

به طور کلی آنالیز قطعات DNA یا همان آنالیز فرگمنت از 4 مرحله تشکیل شده است: استخراج DNA، تکثیر با روش PCR، الکتروفورز مویرگی و تحلیل داده‌ها

مرحله 1: استخراج  DNA

استخراج DNA یک مرحله‌ی حیاتی در فرآیند آنالیز فرگمنت است. کارایی کلی، کیفیت و اندازه‌ی محصول PCR می‌تواند به طور قابل توجهی تحت تأثیر ویژگی‌های خود نمونه و روش انتخابی برای استخراج و خالص‌سازی اسید نوکلئیک قرار گیرد. روش‌های ایده‌آل برای استخراج DNA بسته به منبع یا نوع بافت، نحوه‌ی تهیه‌ی نمونه از منبع، و چگونگی نگهداری و ذخیره‌سازی نمونه پیش از استخراج متفاوت خواهند بود.

مرحله 2: تکثیر قطعات با روش  PCR

برای انجام آنالیز فرگمنت در یک سیستم الکتروفورز مویرگی، باید پرایمرهایی طراحی شوند که ناحیه‌ی مورد نظر را احاطه کنند. رنگ‌های فلورسنت به این پرایمرها متصل می‌شوند و سپس قطعات DNA توسط PCR تکثیر می‌شوند تا آماده‌ی الکتروفورز گردند.

مرحله 3: الکتروفورز مویرگی

قبل از انجام الکتروفورز، باید یک کالیبراسیون طیفی با استفاده از استاندارد ماتریس مناسب برای گروه رنگ‌های انتخاب‌شده بر روی ژنتیک آنالایزر انجام شود تا بتوان پرایمرهای نشاندارشده با رنگ را به‌درستی تشخیص داد. سپس هر نمونه‌ی ناشناخته با استاندارد اندازه و فرمالامید مخلوط می‌شود تا برای الکتروفورز آماده شود. استانداردهای اندازه‌گیری کمک می‌کنند تا اندازه‌ی پیک‌های نمونه تعیین‌شده و تغییرات ناشی از فرآیند تزریق اصلاح شوند.

در طی فرآیند الکتروفورز مویرگی، محصولات PCR به‌صورت الکتروکینتیکی به داخل مویرگ‌های حاوی پلیمر تزریق می‌شوند. سپس با اعمال ولتاژ بالا، قطعات DNA نشاندارشده با فلورسنت بر اساس اندازه از یکدیگر جدا شده و توسط یک سیستم لیزر/دوربین (CCD Camera)  شناسایی می‌شوند.

مرحله 4: تحلیل داده‌ها

نرم‌افزارهای تحلیل داده‌ها یک نمایه از جداسازی قطعات ارائه می‌دهند، اندازه‌ی قطعات را با دقت بالا محاسبه می‌کنند و الل‌های میکروساتلایت موجود در نمونه را شناسایی می‌کنند.

کاربردهای آنالیز فرگمنت

آنالیز فرگمنت امکان اجرای بسیاری از روش‌ها و کاربردهای تحقیقاتی را فراهم می‌کند، از جمله:

• احراز هویت رده‌های سلولی (Cell line authentication)

بسیاری از مجلات علمی و مؤسسات تأمین بودجه، از محققان می‌خواهند که اصالت رده‌های سلولی مورد استفاده در تحقیقاتشان را تأیید کنند. آنالیز قطعات یک روش ساده، کم‌هزینه و بسیار دقیق برای ارائه‌ی اثر انگشت ژنتیکی یک رده‌ی سلولی است.

• بررسی کارایی ویرایش ژنومی با CRISPR-Cas9

در هر آزمایش ویرایش ژنومی، فرآیند ترمیم DNA همیشه کارآمد یا دقیق نیست. آنالیز قطعات می‌تواند کشت‌های اولیه‌ی سلولی را برای تعیین میزان کارایی ویرایش بررسی کند.

• تعیین تک‌نوکلئوتید پلی‌مورفیسم (SNP)

SNPها تغییرات تک‌نوکلئوتیدی هستند که می‌توانند چهار نوع الل مختلف در یک لوکوس خاص ایجاد کنند. SNPها ویژگی‌های ژنتیکی، استعداد ابتلا به بیماری‌ها و پاسخ به درمان‌های دارویی را تعیین می‌کنند. در این روش، به‌جای پرایمر نشاندارشده، از نوکلئوتیدهای نشاندارشده با رنگ فلورسنت در مرحله‌ی PCR استفاده می‌شود.

• آنالیز مارکرهای میکروساتلایت  (Microsatellite marker analysis)

مارکرهای میکروساتلایت، لوکوس‌های DNA چندشکلی و هم‌بارز (Codominant) هستند که شامل توالی‌های تکرارشونده‌ی کوتاه (معمولاً 2 تا 7 نوکلئوتید در هر واحد تکراری) می‌باشند. تعداد واحدهای تکراری در هر فرد ممکن است متفاوت باشد، که باعث ایجاد الل‌هایی با طول‌های مختلف می‌شود. این تنوع برای شناسایی افراد به کار می‌رود، مانند:

• حفاظت از گونه‌های جانوری (Conservation Genetics)
• شناسایی انسانی (Human Identification – HID)، از جمله پزشکی قانونی و تعیین هویت ژنتیکی