فهرست مطالب
آنزیم DNA پلیمراز در بیوتکنولوژی
آنزیم DNA پلیمراز در بیوتکنولوژی یک ابزار کلیدی است و کاربردهای زیادی در تکنیکهای مهمی نظیر واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) که امکان تکثیر سریع و دقیق قطعات DNA را فراهم میکند، دارد. این کاربرد گسترده باعث شده تا DNA پلیمرازها، در زمینههای مختلفی مانند پژوهشهای بنیادین تا تشخیصهای پزشکی و تولید محصولات بیوتکنولوژی، نقشی بیبدیل ایفا کنند. آنزیم DNA پلیمراز از اجزای حیاتی سلولی محسوب میشوند که در همانندسازی و ترمیم DNA نقش اساسی ایفا میکنند. این آنزیمها با توانایی شگفتانگیز خود در ساخت رشتههای جدید DNA از روی الگو، برای حفظ و انتقال اطلاعات ژنتیکی ضروریاند.
تاریخچه آنزیم DNA پلیمراز
آنزیم DNA پلیمراز نخستين بار در سال 1958 کشف شد. آرتور کورنبرگ و همکارانش در باکتری Escherichia coli آنزیم پلیمرازی (Pol I) يافتند که قادر به سنتز DNA بود. به دنبال آن فعالیتهای پلیمرازی دیگری نیز کشف و مشخص شد که این آنزیمها دارای ویژگیهای بسیار متفاوتی هستند. اما تا زمانی که اطلاعات توالی بهطور گسترده در دسترس قرار نگرفت، دلایل این تفاوتهای بیوشیمیایی بهطور دقیق مشخص نشد.
بعد از اینکه تحقیقات بیشتری انجام شد، دانشمندان فهمیدند که در طبیعت، آنزیمهای DNA پلیمراز مسئول تمام فرآیندهای همانندسازی DNA هستند و این کار را با وارد کردن نوکلئوزید مونوفسفاتها به رشته در حال سنتز DNA از طریق مکانیزمی که توسط یونهای فلزی فعال میشود، انجام میدهند. این آنزیم در یوکاریوتها و پروکاریوتها انواع مختلفی دارد.
انواع DNA Polymerase
DNA پلیمرازها آنزیمهایی هستند که با کنار هم قرار دادن نوکلئوتیدها، که واحدهای سازنده DNA هستند، مولکولهای DNA را سنتز میکنند. این آنزیمها نقش حیاتی در فرآیندهای همانندسازی، ترمیم و سایر فعالیتهای سلولی ایفا میکنند. در ادامه، انواع اصلی DNA پلیمرازها بر اساس موجودات زنده و عملکردشان دستهبندی شدهاند:
| دستهبندی | پلیمرازها | نقشهای کلیدی | |
| 1 | پروکاریوتی | Pol I, II, III, IV, V | همانندسازی، ترمیم، عبور از آسیب (TLS) |
| 2 | یوکاریوتی | Pol α, β, γ, δ, ε, ζ, η, κ, ι | همانندسازی، ترمیم، عبور از آسیب (TLS) |
| 3 | ویروسی | پلیمرازهای DNA ویروسی، ترانسکریپتاز معکوس | همانندسازی DNA ویروسی |
| 4 | آرکی | Pol B, Pol D | همانندسازی DNA در آرکیها |
| 5 | مهندسیشده/سنتزی | Taq، Pfu، Phusion، Klenow | PCR و زیستشناسی مولکولی |
DNA پلیمرازهای پروکاریوتی
پلیمراز I:
وظیفه اصلی این آنزیم در پروکاریوتها حذف پرایمرهای RNA و جایگزینی آنها با DNA در طول فرآیند ترمیم و تکمیل رشتههای تازه ساختهشده است. همچنین در پر کردن شکافهای DNA نقش دارد.
پلیمراز II:
این آنزیم در ترمیم DNA نقش دارد و در شرایط آسیب به DNA فعال میشود. وظیفه اصلی آن اصلاح اشتباهات در رشته DNA است.
پلیمراز III:
آنزیم اصلی در همانندسازی DNA در پروکاریوتها است که مسئول سنتز رشتههای پیشرو و پیرو است. این آنزیم دارای فعالیت تصحیح اشتباه 3′ به 5′ است که دقت همانندسازی را افزایش میدهد.
DNA پلیمراز یوکاریوتی
پلیمراز آلفا (α):
در شروع همانندسازی نقش دارد و همراه با پرایماز، پرایمرهای RNA-DNA را سنتز میکند.
پلیمراز دلتا (δ):
در سنتز رشته پیرو و همچنین ترمیم DNA نقش دارد.
پلیمراز اپسیلون (ε):
این آنزیم عمدتاً در سنتز رشته پیشرو فعالیت میکند و نقش مهمی در همانندسازی دقیق DNA دارد.
پلیمراز بتا (β):
به ترمیم پایههای آسیبدیده DNA و پر کردن شکافهای کوچک DNA کمک میکند.
پلیمراز گاما (γ):
مسئول همانندسازی و ترمیم DNA در میتوکندری است.
DNA پلیمراز ویژه یوکاریوتی (خانواده Y):
این گروه شامل آنزیمهایی مانند پلیمراز η (اتا)،ι (ایوتا) و κ (کاپا) است که در عبور از آسیبهای DNA (مانند پیریمیدین دایمرها) و ترمیم آنها نقش دارند.
پلیمراز آرکیها
آرکیها دارای پلیمرازهای مشابه یوکاریوتها مانند پلیمراز B و D هستند که در همانندسازی و ترمیم DNA نقش دارند.
پلیمراز ویروسی
ویروسها دارای DNA پلیمرازهای اختصاصی هستند که به آنها کمک میکند تا DNA خود را همانندسازی کنند. این آنزیمها معمولاً از میزبان مستقل عمل میکنند و به طور گستردهای در طراحی داروهای ضدویروسی بررسی شدهاند.
پلیمراز مهندسی شده و یا سنتزی
پلیمرازهای مهندسیشده یا سنتزی آنزیمهایی هستند که بهطور خاص برای کاربردهای زیستشناسی مولکولی طراحی شدهاند. این آنزیمها معمولاً از منابع میکروبی یا حرارتی مانند باکتریهایThermus aquaticus یا Pyrococcus furiosus استخراج میشوند و برای واکنشهای PCR با ویژگیهایی مانند مقاومت به حرارت یا دقت بالا به کار میروند. این آنزیمها در تحقیقات ژنتیکی، تشخیص بیماریها و تولید محصولات بیوتکنولوژی مورد استفاده گسترده قرار دارند.
- Taq Polymerase
آنزیمی مقاوم به حرارت که از باکتریThermus aquaticus استخراج میشود و به طور گسترده در واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) استفاده میشود.
- Pfu Polymerase
از باکتریPyrococcus furiosus به دست میآید و در واکنشهای PCR با دقت بالا به کار میرود.
- Phusion Polymerase
آنزیمی مهندسیشده برای افزایش فوقالعاده دقت در واکنشهای PCR.
- Klenow Fragment
نسخه کوتاهشدهای از DNA پلیمراز I است که در کاربردهای زیستشناسی مولکولی مانند پر کردن انتهاهای چسبنده DNA استفاده میشود.
DNA پلیمرازهای ترمیم DNA
- پلیمرازهای خاص مانند Pol β، Pol κ، Pol λ، و Pol μ در مسیرهای مختلف ترمیم نقش دارند، از جمله این مسیرها:
- ترمیم نوکلئوتیدهای آسیبدیده (NER): ترمیم آسیبهای گستردهای مانند دیمرهای تیمین.
- ترمیم بازهای آسیبدیده (BER) : اصلاح آسیبهای کوچک مانند حذف گروههای آمین.
- اتصال غیرهمولوگ انتهاها (NHEJ) : ترمیم شکستگیهای DNA دو رشتهای.
ساختار آنزیم DNA پلیمراز
با دسترسی به توالی اولیه، آشکار شد که پلیمرازها با وجود شباهتهای تکاملی، از یکدیگر فاصله گرفتهاند و مقایسه ویژگیهای توالی آنها به ایجاد دستهبندیهایی انجامید که هنوز هم مورد استفاده قرار میگیرند. ولی جالب اینجاست که با وجود شباهت کم در توالیهای اسید آمینه، ساختار کلی بیشتر این آنزیمها ویژگیهای مشترکی دارد. این ساختار کلی شبیه به دست راست و شامل زیرواحدهای «کف دست»، «شست» و «انگشتان» است. بخش «کف دست» شامل رزیدوهای مهمی برای کاتالیز است و همولوژی آن در بیشتر خانوادههای DNA پلیمراز مشاهده شده است. در مقابل، زیرواحدهای «شست» و «انگشتان» ممکن است بین DNA پلیمرازهای مختلف تفاوتهای قابل توجهی داشته باشند که منجر به تنوع قابل ملاحظهای در ویژگیهای این آنزیمها میشود. علاوه بر این، دومینهای دیگر مانند اگزونوکلئاز ‘3 به ‘5 یا اگزونوکلئاز ‘5 به ‘3 میتواند قابلیتهای بیشتری به آنزیم بدهد.
DNA پلیمراز مقاوم به حرارت
کشف باکتریThermus aquaticus و آنزیم پلیمراز آن در سال 1969 توسط توماس بروک و دستیارش هادسون فریز انجام شد. آنها این باکتری را در چشمههای آب گرم پارک ملی یلواستون کشف کردند که در دمای بسیار بالا (تا 170 درجه فارنهایت) زنده میماند. با گذشت سالها، محققان دریافتند که آنزیمTaq DNA Polymerase که از این باکتری استخراج میشود، در دمای بالای مورد نیاز برای واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) پایدار است و به همین دلیل برای تکثیر DNA در این فرایند حیاتی است. این کشف منجر به توسعه و گسترش PCR شد که کاربردهای وسیعی در تحقیقات ژنتیک و بيوتكنولوژي پیدا کرد.
اهمیت و کاربرد DNA پلیمراز
با پیشرفت علم و استفاده از تکنیکهای مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، کاربردهای گوناگونی برای آنزیم DNA پلیمراز مطرح شد که میتوان به موارد زیر اشاره کرد:
- استفاده در PCR
- تعیین توالی DNA
- امور تحقیقاتی
- Cloning ژن و ژن درمانی
بسیاری از تکنیکهای زیستفناوری که در پژوهشهای بنیادی و همچنین در تشخیصهای بالینی روزانه استفاده میشوند، به DNA پلیمرازها و قابلیت ذاتی آنها در همانندسازی رشتههای DNA با دقت فوقالعاده بالا وابسته هستند.
در سالهای اخیر،DNA پلیمرازهایی برای کاربردهای گوناگون PCR و تعیین توالی بهینه شدهاند و همچنین آنزیمهایی که طیف وسیعی از سوبستراهای غیرطبیعی را برای سنتز و رونویسی معکوس اسیدهای نوکلئیک اصلاحشده میپذیرند، توسعه یافتهاند. ولی لازم است که DNA پلیمراز با ویژگیهای بهینه ابتدا از طریق مهندسی پروتئين و تکامل هدایتشده (انتخاب مصنوعي) بر اساس آنزیمهای طبیعی تولید شود.
نحوه تولید آنزیم DNA پلیمراز نوترکیب
مهم ترین آنزیم پلیمرازی که در تستهای مولکولی از جمله PCR، توالی یابی و کلونینگ استفاده میشود، آنزیم Taq DNA Polymerase و هم خانوادههای آن است که یک آنزیم پایدار حرارتی است و که از باکتری T. aquaticus استخراج شده و نقش بسیار مهمی در همانندسازی و تکثیر DNA دارد.
تولید آنزیم DNA پلیمراز نوترکیب، یک گام مهم در علم زیستفناوری بود که پس از کشفTaq DNA polymerase به وقوع پیوست. در دهه ۱۹۸۰، محققان شروع به تولید نسخههای نوترکیب این آنزیم کردند تا بتوانند تولید آن را در مقیاس وسیعتری انجام دهند و از ویژگیهای منحصر بهفرد آن در واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) بهرهمند شوند.
تکنولوژی DNA نوترکیب به محققان این امکان را داد که ژن مسئول کد کردنTaq DNA polymerase را شناسایی و به داخل میزبانهای مناسب مثل باکتریEscherichia coli منتقل کنند. این فرایند اجازه داد تا آنزیم در شرایط آزمایشگاهی و با کنترل بیشتر تولید شود و وابستگی به استخراج مستقیم ازT. aquaticus کاهش یابد. نسخههای نوترکیبTaq DNA polymerase نه تنها مقرون به صرفهتر و با کیفیت بالاتر بودند، بلکه توانستند به دلیل تطابق با شرایط آزمایشگاهی، در تولید گسترده و کاربردهای صنعتی، به ویژه در ژنتيك مولکولی و تشخیصهای ژنتیکی، مورد استفاده قرار گیرند.
این توسعه همچنین باعث شد آنزیمهای پلیمراز دیگری که خصوصیات متفاوت و کاربردهای خاصی دارند، به صورت نوترکیب تولید شوند و علم زیستفناوری به سمت اصلاح و بهینهسازی آنزیمها برای کاربردهای تخصصیتر حرکت کند.
ساختار و فعالیت آنزیم Taq DNA Polymerase
Taq DNA Polymerase حدوداً ۹۴ کیلو دالتون وزن دارد و سنتز رشتههای مکمل DNA را در جهت ‘5 به ‘3 کاتالیز میکند و دارای فعالیت اگزونوکلئازی ‘5 به ‘3 نیز هست. این آنزیم فاقد فعالیت اگزونوکلئازی ‘3 به ‘5 برای تصحیح اشتباهات (Proofreading) است، که همین امر باعث نرخ خطای نسبی بالای آن (حدود ۱ اشتباه در هر 105 تا 106 جفت باز) میشود.
DNA پلیمراز شرکت زیستفناوری کوثر
DNA پلیمراز یکی از محصولات کلیدی شرکت زیستفناوری کوثر است که با کیفیت بالا و سازگاری مطلوب برای انواع فرآیندهای آزمایشگاهی تولید شده است. این آنزیم نقش حیاتی در تکنیکهای مولکولی نظیر PCR، کلونینگ، و سنتز DNA دارد و به دلیل خلوص بالا و عملکرد مطمئن، مورد اعتماد بسیاری از آزمایشگاهها و محققین قرار گرفته است.
ویژگیهای KBC DNA Polymerase:
- خلوص بالا: تضمین حداقل آلودگی آنزیمی و عملکرد دقیق.
- کاربرد گسترده: مناسب برای انواع آزمایشها از جمله Real-Time PCR و واکنشهای حساس به دما.
- پایداری حرارتی: کارایی بالا در دماهای مختلف، به ویژه در فرآیندهای نیازمند دناتوراسیون.
موارد استفاده KBC DNA Polymerase:
- واکنشهای زنجیرهای پلیمراز (PCR)
- توالییابی DNA
- مهندسی ژنتیک و کلونینگ
- تحقیق در زمینه تشخیص بیماریهای ژنتیکی
اطلاعات تکمیلی
این محصول در بستهبندیهای مختلف عرضه میشود و اطلاعات فنی دقیقتر، از جمله نحوه استفاده و شرایط نگهداری، در بروشور محصول موجود است. برای دریافت اطلاعات بیشتر یا ثبت سفارش، به مراجعه کرده و یا با ما در باشید.
مطالعه بیشتر انواع DNA Polymerase
- "Multiple functions of DNA polymerases", Authors: Hübscher, U., & Spadari, S., Journal: PubMed Central, DOI: 10.1093/nar/27.18.3643
- "DNA polymerase II, the probable homolog of mammalian DNA polymerase epsilon, replicates chromosomal DNA in the yeast Saccharomyces cerevisiae", Authors: Araki, H., & Ropp, P. A., Journal: PubMed Central, DOI: 10.1073/pnas.87.21.8403
- "A phenotype for enigmatic DNA polymerase II: A pivotal role for pol II in replication restart in UV-irradiated Escherichia coli", Authors: Rangarajan, S., Woodgate, R., & Goodman, M. F., Journal: Proceedings of the National Academy of Sciences, DOI: 10.1073/pnas.96.16.9224
- "Discovery of DNA Polymerase"
- Authors: Kornberg, A., Journal: Journal of Biological Chemistry, DOI: 10.1016/S0021-9258(20)83521-2
- "DNA polymerase η contributes to genome-wide lagging strand synthesis"
- Authors: Bergoglio, V., et al., Journal: Nucleic Acids Research, DOI: 10.1093/nar/gkz024
- "Characterization and engineering of a DNA polymerase reveals a role of the non-catalytic metal in nucleotide selection"
- Authors: Gardner, A. F., & Jack, W. E., Journal: BMC Molecular and Cell Biology, DOI: 10.1186/s12860-019-0216-1
منابع
- Joos Aschenbrenner, Andreas Marx, DNA polymerases and biotechnological applications, Current Opinion in Biotechnology, Volume 48, 2017, Pages 187-195, ISSN 0958-1669, https://doi.org/10.1016/j.copbio.2017.04.005.
- Garcia-Diaz M, Bebenek K. Multiple functions of DNA polymerases. CRC Crit Rev Plant Sci. 2007 Mar;26(2):105-122. doi: 10.1080/07352680701252817. PMID: 18496613; PMCID: PMC2391090.
- Fatima Akram, Fatima Iftikhar Shah, Ramesha Ibrar, Taseer Fatima, Ikram ul Haq, Waqas Naseem, Mahmood Ayaz Gul, Laiba Tehreem, Ghanoor Haider, Bacterial thermophilic DNA polymerases: A focus on prominent biotechnological applications, Analytical Biochemistry, Volume 671, 2023, 115150, ISSN 0003-2697, https://doi.org/10.1016/j.ab.2023.115150.
